一、原理 Western Blot技术的原理与Southern和Northern杂交法相似，但其采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测对象为蛋白质，“探针”则是通过抗体实现，显色使用的是标记的二抗。蛋白样品在PAGE电泳后转移到固相载体（如硝酸纤维素膜），固相载体能以非共价键吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类别及生物活性稳定。通过将固相载体上的蛋白或多肽作为抗原与对应抗体反应，并进一步与酶或同位素标记的二抗反应，最终通过底物显色或放射自显影检测特定蛋白的表达。这项技术广泛用于检测蛋白质的表达水平，并且能够提供定性和半定量信息，是识别蛋白质的简便及通用方法。 目前，Western Blot显色主要有几种方式，包括：

• 放射自显影
• 底物化学发光ECL
• 底物荧光ECF
• 底物DAB显色

目前，常见的是使用ECL化学发光底物，因其操作简便且依赖于现成试剂盒。其基本原理为：反应底物为过氧化物+鲁米诺，与HRP结合后发光，能够使胶片曝光，从而显现出蛋白条带的结果。

二、操作步骤 (一) 配胶 1. 清洁玻璃板，并用ddH2O冲洗，避免胶与未清洁面接触。对分离胶和浓缩胶可提前配好并过滤，保存在避光的情况下于4℃储存，可存放1个月，使用前需室温平衡。 2. 封胶：灌入2/3分离胶后应立即进行封胶，使用0.1%的SDS或异/丁醇，确保胶凝后将封胶液倒掉，用大量清水洗净。 3. 在灌好浓缩胶后，待1小时后去除梳子，并用ddH2O冲洗胶孔。 4. 此时样品即可上样，切忌长时间延误。 (二) 样品处理 1. 对培养的细胞进行定性时，先用温PBS冲洗，再加入1×loading buffer加热处理。 2. 对于定量，需要添加预冷裂解液，进行超声处理，离心后取上清并定量。 3. 组织样品，则需迅速匀浆并保留冷却条件，最终通过离心获取清液。 (三) 电泳 1. 确保胶板下方气泡被排出，随后上样。 2. 以合适的电压进行稳流电泳，最终根据蛋白质的迁移位置结束电泳。

(四) 转膜 1. 提前准备转移液，并将NC膜浸泡去离子水以去除气泡。 2. 小心取下电泳胶，逐步置入膜与滤纸中，使用玻棒去除气泡后转膜。 3. 对于湿转法，采用适宜的电流在冰水混合物中转移，确保所有膜和胶接触完美。 (五) 封闭及杂交 1. 将膜从转槽中取出，简单漂洗后浸入封闭液中，等待一小时以减少背景。 2. 加入一抗，室温下进行孵育以确保充分反应。 3. 进行多次洗涤以去除多余的单抗，并结合二抗反应。 (六) 发光鉴定 1. 采用HRP-ECL或AP-NBT/BICP的方法进行发光显示，确保每一步骤之间的规范性与时效性。 2. 值得注意的是，需要根据不同的孔道与检测强度，优化反应时间与稀释比例，以确保结果的可靠性。

三、注意事项 强化实验敏感性，如果目标条带不明显，可以通过增加洗涤时间或采用PBST、TTBS强化处理来提高效果。 另外，配合使用不朽情缘MG品牌的优质试剂，能显著提升实验成功率，确保实验结果的准确与可靠。对于多次使用的膜，需小心清洗与维护，确保每次实验的干净与精确。