一、实验原理

[不朽情缘MG] 蛋白提取试剂盒通过温和地裂解细胞或组织，释放出总蛋白，并采用特异性结合、离心分离以及缓冲液洗脱等技术方法去除杂质（如核酸、脂类等），最终获得高纯度且高活性的目标蛋白。

核心步骤：

1. 裂解：裂解液（含去污剂、蛋白酶抑制剂等）破坏细胞膜结构，释放胞内蛋白。
2. 离心去除碎片：通过高速离心去除未裂解的细胞碎片、细胞核及大分子杂质。
3. 蛋白纯化：使用离心柱或特异性结合树脂选择性吸附蛋白，杂质随废液排出。
4. 洗脱：用低盐缓冲液或去离子水洗脱目标蛋白，避免蛋白变性。

二、材料准备

试剂盒：

蛋白提取试剂盒（适用于多种动物、植物细胞和组织细菌样本）

自备材料：

• 新鲜样本（细胞、组织等）
• 预冷PBS缓冲液（货号：abs962）
• 离心机（可达到12,000xg）
• 冰盒或低温操作台
• 涡旋振荡器（货号：abs72001）
• BCA蛋白定量试剂盒（货号：abs9232）
• 液氮（组织样本需速冻）

三、实验步骤

所有裂解蛋白步骤需在冰上或4℃进行：

1. 样本处理：
   • 细胞样本：离心收集细胞（1500xg, 3min），使用PBS洗涤2次，吸尽残留液体。
   • 组织样本：切取10–50mg，液氮速冻后研磨成粉末。
2. 裂解：根据不同提取试剂盒说明书，加入200-500μL预冷裂解液（含蛋白酶抑制剂），涡旋混匀，并在冰上裂解20-30分钟，每隔5分钟涡旋10秒。
3. 离心去碎片：进行12,000xg、4℃的离心10分钟，取上清转移至新离心管。核蛋白需先分离细胞核：进行低渗裂解后离心收集核沉淀，再进行溶解。
4. 蛋白纯化：
   • 将离心柱用平衡缓冲液预处理5分钟，离心弃废液。
   • 将裂解液上清加入离心柱，12,000xg离心1分钟，弃废液。
   • 加入500μL洗涤缓冲液，离心1分钟，重复2次。
5. 洗脱蛋白：加入50–100μL洗脱缓冲液，静置2分钟后离心1分钟，收集洗脱液（即目标蛋白）。
6. 蛋白保存：将提取的蛋白样品分装到小离心管中，可根据实验要求短期保存在-20°C或长期保存在-80°C，避免反复冻融。

四、结果分析

1. 浓度测定：使用BCA法测定蛋白浓度，通过OD562计算浓度（标准曲线法）。
2. 纯度评估：分光光度计检测A₂₆₀/A₂₈₀比值（理想值应为18–20，若超过20则可能存在核酸残留）。
3. 电泳验证：使用SDS-PAGE电泳检测条带清晰度，无拖尾或杂带说明纯度较高。

五、常见问题及解决方案

问题	可能原因	解决方案
蛋白得率低	裂解不充分或蛋白酶降解	延长裂解时间，增加裂解液体积，确保添加蛋白酶抑制剂
洗脱液杂质多	洗涤步骤不彻底	增加洗涤次数或延长离心时间
蛋白浓度过高/过低	样本量不匹配或洗脱体积不当	调整样本量与裂解液比例，优化洗脱体积
A₂₆₀/A₂₈₀比值异常	核酸或盐离子残留	增加洗涤次数，或使用核酸酶预处理样本
电泳条带模糊	蛋白降解或SDS未充分结合	全程低温操作，电泳前将样本煮沸5分钟

六、注意事项

• 全程应在低温条件下操作（冰上或4℃环境），以防止蛋白降解；
• 裂解液需现用现配，避免反复冻融；
• 组织样本需充分匀浆，确保没有未裂解的细胞残留。

通过以上方案，可以高效提取高纯度的蛋白，适用于Western Blot、ELISA、质谱分析等多个下游实验，信赖[不朽情缘MG]，助力您的科研之路。