mRNA技术的崛起与挑战

不朽情缘MG作为一家领先的生物技术公司，在mRNA技术这一新兴领域展现了巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，该技术为疾病的预防和治疗开辟了全新的解决方案。然而，mRNA技术的发展过程中面临诸多挑战，其中副产物双链RNA（dsRNA）的形成是最大的难题之一。dsRNA作为一种免疫刺激分子，能够引发机体的免疫反应，进而对mRNA的安全性和有效性产生影响。因此，如何有效减少dsRNA的生成已成为mRNA技术领域亟待解决的关键问题。

传统解决方案的局限性

传统的解决方法通常依赖于复杂的纯化工艺，这一过程不仅成本高、效率低，而且难以彻底清除微量dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）中的重要工具，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性，包括末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性，被认为是dsRNA形成的主要因素。因此，如何通过定向进化或理性设计来改造T7RNAP，成为全球研究团队的重点。

我们的研究与创新

在2024年3月3日，我们的团队在FEBS Journal上发表了一篇论文，题为“Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities”。通过对T7RNAP的工程化改造，我们在体外转录过程中显著降低了dsRNA的生成（只有野生型的18%），同时提升了mRNA的整体合成效率与质量。这一成果为基因治疗和疫苗开发领域的快速进展提供了强有力的支持。

通过工程化改造实现突破

我们创新性地结合了定向进化与半理性设计的方法，成功筛选出多个高效、低毒的T7RNAP突变体。这些突变体在减少dsRNA生成方面表现突出。我们构建了随机突变库，并设计了一种能够实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，利用荧光激活液滴分选（FADS）技术进行了超高通量筛选。最终，我们筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），其dsRNA含量显著低于野生型。

半理性设计的成功应用

通过半理性设计，我们构建了十个单点饱和突变库，并使用微孔板筛选技术找到了有益的突变体。微孔板筛选中采用了双探针，其中引入的5’-end探针用于检测RNA产量。在筛选超过1000个突变体后，我们发现Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）的dsRNA生成量显著低于野生型，同时未影响转录效率。为进一步优化，我们基于上述突变位点构建了DNA重组文库，并通过微孔板筛选得到了组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E），该突变体的dsRNA量仅为野生型的18%。

突破性成果的验证

这一结果不仅在体外实验中得到了验证，在细胞实验中也显示出显著降低免疫原性及提高蛋白翻译效率的效果。当我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11的干扰素β（IFN-β）mRNA和蛋白表达量仅为野生型的97%和1293pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，荧光强度稳定。这说明，通过减少dsRNA可以有效解除PKR介导的翻译抑制，从而释放mRNA技术在治疗中的潜力。

深入探讨突变体的作用机制

为了更深入理解突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，突变体的dsRNA降低主要源于RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）和末端转移酶活性的降低。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论依据。

促进mRNA技术发展的新动力

本研究为T7RNAP的改造开辟了新的方法和思路，同时为mRNA技术的发展注入了新活力。通过减少dsRNA的形成，提升了mRNA的质量和安全性。凭借这一研究成果，不朽情缘MG成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNA聚合酶GMP级（低dsRNA，250U/μL））。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域的应用潜力广泛，有望进一步推动mRNA技术的蓬勃发展，为生物医学领域带来更多的可能性。

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